Valutazione della penetrazione elettrica delle membrane cellulari utilizzando quattro

Microsistemi e nanoingegneria volume 8, numero articolo: 68 (2022) Citare questo articolo

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La penetrazione elettrica della membrana cellulare è vitale per determinare l'interno della cellula tramite citometria ad impedenza. Qui proponiamo un metodo per determinare la conduttività della membrana cellulare attraverso i livelli di inclinazione degli impulsi di impedenza. Quando avviene la penetrazione elettrica, una corrente ad alta frequenza passa liberamente attraverso la membrana cellulare; quindi, la distribuzione intracellulare può agire direttamente sugli impulsi di impedenza ad alta frequenza. La simulazione numerica mostra che una distribuzione non uniforme dei componenti intracellulari può influenzare i livelli di inclinazione degli impulsi di impedenza e i livelli di inclinazione iniziano ad aumentare quando la membrana cellulare viene penetrata elettricamente. L'evidenza sperimentale mostra che frequenze di rilevamento più elevate (>7 MHz) portano a una distribuzione più ampia dei livelli di inclinazione degli impulsi di impedenza quando si misurano popolazioni cellulari con citometria di impedenza a quattro frequenze. Questo risultato ci permette di determinare che una frequenza di rilevamento di 7 MHz è in grado di passare attraverso la membrana delle cellule di Euglena gracilis (E. gracilis). Inoltre, forniamo una possibile applicazione della citometria a impedenza a quattro frequenze nel monitoraggio della biomassa di singole cellule di E. gracilis. È possibile applicare un'impedenza ad alta frequenza (≥7 MHz) per monitorare questi cambiamenti della biomassa e un'impedenza a bassa frequenza (<7 MHz) per monitorare i corrispondenti cambiamenti del biovolume. Nel complesso, questo lavoro dimostra un metodo di determinazione semplice per la penetrazione elettrica della membrana cellulare e la piattaforma proposta è applicabile per la valutazione multiparametrica dello stato cellulare durante la coltivazione.

La valutazione della biomassa delle singole cellule svolge un ruolo fondamentale in molti settori, compresa l'analisi dello stato cellulare1 e del meccanismo di crescita cellulare2, nonché le questioni ambientali ed energetiche3,4. Ad oggi, diverse tecniche, tra cui l'imaging di cellule vive5, la citometria a flusso Raman6 e le sonde chimiche7, sono state applicate con successo per la valutazione ad alto rendimento della biomassa intracellulare nelle singole cellule. Tuttavia, la maggior parte di questi approcci basati sull’ottica richiedono molto tempo e manodopera, e i severi requisiti per il mantenimento e la calibrazione dei punti di focalizzazione del fascio ne limitano la robustezza e la portabilità. In questo lavoro, abbiamo proposto un metodo più efficace e conveniente per caratterizzare la biomassa attraverso l'entità dei segnali di impedenza ad alta frequenza.

In alternativa, è stato dimostrato che la citometria a impedenza è applicabile per la caratterizzazione di singole cellule in modo privo di etichetta ed economicamente vantaggioso8. Ad oggi, la citometria ad impedenza è stata impiegata con successo per analizzare la morfologia9, la rigidità10 e gli stati11 delle singole cellule. È stato dimostrato che l'entità e la morfologia degli impulsi di impedenza dipendono rispettivamente dal volume12 e dalla forma13 delle singole cellule. Inoltre, la ricerca ha scoperto che il rilevamento dell'impedenza ad alta frequenza è applicabile per caratterizzare le proprietà della membrana14,15. Ad esempio, la conduttività della membrana cellulare aumenta all'aumentare della frequenza di rilevamento superiore a 1 MHz14 e la conduttività della membrana è correlata alla vitalità cellulare. Sui et al.16 e Zhong et al.17 hanno dimostrato che una frequenza di rilevamento di 5–8 MHz è sufficiente per consentire alla corrente di passare attraverso le membrane delle cellule viventi dei mammiferi. Questa conclusione è tratta dalle differenze nella conduttività della membrana tra cellule inattivate e cellule viventi. Senza un confronto con le cellule inattivate, ci sono pochi resoconti di metodi applicabili per determinare direttamente se la membrana è conduttiva.

Quando si misura la biomassa intracellulare con la citometria ad impedenza, è necessario determinare la frequenza di rilevamento che può penetrare nella membrana cellulare. La nostra soluzione consiste nel quantificare il livello di inclinazione degli impulsi di impedenza come indice di inclinazione13 e quindi valutare la conduttività della membrana cellulare attraverso l'indice di inclinazione della popolazione cellulare a diverse frequenze di rilevamento. Sulla base del nostro lavoro precedente, è stato scoperto che la distribuzione dei componenti intracellulari influenza il livello di inclinazione degli impulsi di impedenza ad alta frequenza (6 MHz)18,19 perché una corrente ad alta frequenza può propagarsi all'interno di singole cellule tra componenti intracellulari non conduttivi. Al contrario, una corrente a bassa frequenza (500 kHz) non può penetrare nella membrana cellulare e si propaga principalmente attorno alla cellula18,19. Questa caratteristica facilita un nuovo metodo per determinare la frequenza di rilevamento dell'interno e dell'esterno della cella in base all'indice di inclinazione degli impulsi di impedenza. Gli interni delle cellule sono più eterogenei delle loro morfologie in una popolazione. Quando la frequenza di rilevamento è sufficientemente elevata da penetrare nella membrana cellulare, l'indice di inclinazione degli impulsi di impedenza per una popolazione cellulare sarà più vario. A nostra conoscenza, questa è la prima volta che il livello di inclinazione degli impulsi di impedenza è stato utilizzato per determinare la frequenza di rilevamento dell'interno della cella.