Meccanismi di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana nelle "bicelle"

Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 11109 (2022) Citare questo articolo

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Nonostante i notevoli progressi, dovuti principalmente allo sviluppo della LCP e della cristallizzazione delle "bicelle", la mancanza di informazioni strutturali rimane un collo di bottiglia nella ricerca sulle proteine ​​di membrana (MP). Una delle ragioni principali è l’assenza di una comprensione completa del meccanismo di cristallizzazione. Qui presentiamo studi di diffusione a piccolo angolo dell'evoluzione della matrice di cristallizzazione "bicelle" nel corso della crescita dei cristalli MP. Inizialmente, la matrice corrisponde allo stato bicelle simile a un liquido. Tuttavia, dopo l'aggiunta del precipitante, la matrice di cristallizzazione si trasforma in uno stato gelatinoso. I dati suggeriscono che questa fase finale è composta da doppi strati nastriformi interconnessi, dove crescono i cristalli. Appare una piccola quantità di fase multilamellare e il suo volume aumenta contemporaneamente al volume dei cristalli in crescita. Suggeriamo che la fase lamellare circonda i cristalli ed è fondamentale per la crescita dei cristalli, che è comune anche per la cristallizzazione LCP. Lo studio svela i meccanismi di cristallizzazione delle MP "bicelle" e supporterà la progettazione razionale della cristallizzazione.

Le proteine ​​di membrana (MP) svolgono un ruolo essenziale nei processi delle cellule viventi come il trasporto degli ioni attraverso la membrana, la conversione dell'energia e la trasduzione del segnale1,2. Un terzo del genoma umano codifica per proteine ​​di membrana. A causa del loro ruolo significativo nella fisiologia umana, le proteine ​​di membrana sono il bersaglio di circa il 60% dei farmaci attualmente utilizzati3,4. Ad oggi, il metodo più utilizzato per ottenere strutture proteiche ad alta risoluzione è la cristallografia a raggi X, che richiede cristalli proteici di alta qualità. Tuttavia, la cristallizzazione delle proteine ​​di membrana rimane una sfida importante. Le strutture uniche delle proteine ​​di membrana5 rappresentano solo circa l'1% di tutte le strutture proteiche uniche ad alta risoluzione disponibili6. Uno dei metodi in meso è la cristallizzazione in una miscela bicellare7,8,9,10,11. Tuttavia, questo metodo porta alla delucidazione di numerosi importanti MP, il cui meccanismo non è ancora chiaro e si basa solo su tentativi ed errori esaustivi. Il termine "cristallizzazione da bicelle" può riferirsi solo allo stato iniziale della matrice e l'evoluzione dello stato bicelle verso una matrice in grado di supportare la crescita dei cristalli non è stata chiarita.

Sono stati compiuti sforzi considerevoli per sviluppare nuovi metodi, materiali e strumenti che potrebbero aiutare a superare questi ostacoli. Tuttavia, nonostante i tentativi passati, la velocità di deposizione delle strutture proteiche di membrana (la prima struttura proteica di membrana fu depositata nel 1985) è ancora lontana da quella raggiunta per le proteine ​​solubili.

Per superare la sfida, nel 1996 è stato introdotto un nuovo metodo, ovvero la cristallizzazione delle MP nella matrice della fase cubica lipidica (LCP). Questo approccio ha consentito la cristallizzazione di MP impegnative (ad esempio, rodopsine 13,14,15 e recettori accoppiati a proteine ​​G) che hanno resistito per decenni alla cristallizzazione con i metodi standard di diffusione del vapore16,17,18.

L'approccio della cristallizzazione in meso è stato ulteriormente sviluppato e ampliato con altri metodi e strumenti, ad esempio l'utilizzo di lipidi con proprietà diverse per creare la matrice LCP19, cristallizzazione da nanodischi basati su MSP20 o legati a polimeri21,22 e cristallizzazione da bicelle7,9 ,10.

In precedenza, le bicelle erano state introdotte come modello che imitava la membrana potenzialmente superiore alle micelle23. È stato dimostrato che alcune miscele di lipidi e detergenti formano particelle a forma di disco, con un doppio strato lipidico, un nucleo e un bordo stabilizzato dal detergente che fornisce un ambiente stabilizzante per le MP imitando le membrane cellulari native. La dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) è spesso utilizzata come componente fosfolipidico a catena lunga delle bicelle e può essere drogata con fosfolipidi con lunghezze di catena simili ma gruppi di teste diversi. D'altra parte, il bordo può essere stabilizzato da un derivato a catena corta del sale biliare come il 3-(colammidopropil) dimetilammonio-2-idrossi-1-propansolfonato (CHAPSO). Poiché il fosfolipide a catena lunga nelle bicelle è sequestrato nella regione centrale planare, che è priva di fosfolipidi a catena corta o detergente, la regione centrale di una bicella imita una sezione di membrana naturale molto meglio delle micelle detergenti convenzionali. La dimensione e le proprietà di queste particelle lipidiche possono essere variate in funzione del rapporto tra un lipide a catena lunga e un detergente o un lipide a catena corta (rapporto Q) e la concentrazione di lipidi. La variazione di Q fornisce una varietà di fasi bicelle simili che sono suscettibili di diversi tipi di studi biologici. In generale, con un elevato rapporto lipidico (Q > 2) e un ampio intervallo di concentrazioni (Clp = 0,25–25% (p/p)), si formano bicelle con un diametro di circa 100–500 Å24,25,26,27 ,28,29,30,31,32,33. La diminuzione di Q si traduce in bicelle più piccole24,34,35,36.