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Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 6857 (2023) Citare questo articolo

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I vettori virali rappresentano un collo di bottiglia nella produzione di terapie cellulari. L'elettroporazione è emersa come approccio per la trasfezione non virale di cellule primarie, ma gli approcci standard basati su cuvette soffrono di bassa produttività, difficile ottimizzazione e incompatibilità con la produzione di cellule su larga scala. Qui presentiamo una nuova piattaforma di elettroporazione in grado di eseguire un'elettroporazione rapida e riproducibile in grado di trasfettare in modo efficiente piccoli volumi di cellule per la ricerca e l'ottimizzazione dei processi e di adattarsi ai volumi richiesti per le applicazioni nella terapia cellulare. Dimostriamo la consegna di DNA plasmidico e mRNA alle cellule T umane primarie con elevata efficienza e vitalità, come un'efficienza di trasfezione > 95% per la consegna di mRNA con perdita < 2% di vitalità cellulare rispetto alle cellule di controllo. Presentiamo metodi per ridimensionare la consegna che raggiungono una produttività sperimentale di 256 milioni di cellule/min. Infine, dimostriamo una modifica terapeuticamente rilevante delle cellule T primarie utilizzando CRISPR/Cas9 per abbattere l'espressione del recettore delle cellule T (TCR). Questo studio mostra le capacità del nostro sistema di rispondere alle esigenze insoddisfatte di un’ingegneria efficiente e non virale delle cellule T per la produzione di cellule.

Le terapie cellulari hanno suscitato entusiasmo per il loro potenziale nel trattamento di una varietà di malattie ereditarie e acquisite. In particolare, le immunoterapie che utilizzano cellule T autologhe modificate per esprimere i recettori dell’antigene chimerico (CAR) hanno raggiunto tassi notevoli di risposta completa con remissioni durature e durature per alcuni tumori ematologici. La ricerca è diretta verso il trattamento di altri tumori come i tumori solidi. Tuttavia, la prima generazione di terapie cellulari CAR-T approvate si basa su vettori virali come il lentivirus o il virus adeno-associato (AAV) per la riprogrammazione cellulare1,2,3,4,5. I vettori virali hanno consentito la trasduzione ad alta efficienza di cellule immunitarie umane primarie difficili da trasfettare, ma presentano diversi inconvenienti legati ai loro processi di produzione complessi e costosi, all'immunogenicità e al potenziale di mutagenesi inserzionale6,7,8. Inoltre, il campo tende verso metodi di riprogrammazione più complessi, come modifiche genetiche multiple tramite tecnologia CRISPR/Cas9 e inserimento genico mediante elementi trasposoni, che non sono compatibili con i limiti di confezionamento tipici associati agli approcci virali9,10,11,12,13.

Per aggirare queste limitazioni, gli sforzi di ricerca si sono concentrati sempre più su metodi di trasfezione non virale per sostituire la consegna virale9,14,15. Tra i metodi di trasfezione non virale, l'elettroporazione è un approccio ben studiato comunemente utilizzato per fornire DNA, RNA e proteine ​​nelle cellule ed è riconosciuto come uno dei principali contendenti per la sostituzione dei vettori virali. Ad esempio, Bozza et al., hanno dimostrato la capacità di utilizzare l'elettroporazione per generare cellule T ricombinanti utilizzando nanovettori di DNA non integrativi che aggirano molti degli inconvenienti associati agli approcci virali8. Allo stesso modo, l’elettroporazione è stata recentemente utilizzata per generare cellule CAR-T attraverso l’uso del sistema di trasposoni della Bella Addormentata per il primo studio clinico con cellule CAR-T prive di virus in Europa16 e con il sistema piggyBac17.

Nel metodo standard di elettroporazione statica utilizzato da molti anni, viene creato un campo elettrico applicando impulsi elettrici ad alta tensione alle sospensioni cellulari all'interno di una cuvetta18. Gli impulsi ad alta tensione applicati creano pori transitori nella membrana cellulare che consentono alle molecole di diffondersi nelle cellule19,20. Tuttavia, un’eccessiva intensità del campo elettrico può produrre la rottura irreversibile della membrana cellulare e la morte cellulare. Nel processo standard, la tensione dell'impulso, il numero di impulsi e la durata dell'impulso sono tra i parametri variati empiricamente per ottimizzare l'efficienza dell'inserimento molecolare e la sopravvivenza cellulare. L'ottimizzazione empirica può essere noiosa e può esserci variabilità nel processo dovuta, tra le altre cose, alla posizione casuale delle celle rispetto agli elettrodi21. Inoltre, i metodi standard di elettroporazione in cuvetta hanno una produttività limitata, incompatibile con la produzione di celle su larga scala o automatizzata22. Pertanto, le limitazioni sull'efficienza del trasferimento molecolare, sulla vitalità cellulare, sulla variabilità del processo e sulla produttività limitata hanno limitato l'applicazione diffusa di questo metodo, anche se sono compresi i potenziali vantaggi rispetto all'uso di vettori virali.