I neuroni che ripristinano la deambulazione dopo la paralisi

Natura volume 611, pagine 540–547 (2022)Citare questo articolo

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Una lesione del midollo spinale interrompe i percorsi dal cervello e dal tronco encefalico che proiettano al midollo spinale lombare, portando alla paralisi. Qui mostriamo che la stimolazione elettrica epidurale spaziotemporale (EES) del midollo spinale lombare1,2,3 applicata durante la neuroriabilitazione4,5 (EESREHAB) ha ripristinato la deambulazione in nove individui con lesioni croniche del midollo spinale. Questo recupero ha comportato una riduzione dell’attività neuronale nel midollo spinale lombare degli esseri umani durante la deambulazione. Abbiamo ipotizzato che questa riduzione inaspettata rifletta la selezione attività-dipendente di specifiche sottopopolazioni neuronali che diventano essenziali per consentire a un paziente di camminare dopo una lesione del midollo spinale. Per identificare questi presunti neuroni, abbiamo modellato le caratteristiche tecnologiche e terapeutiche alla base di EESREHAB nei topi. Abbiamo applicato il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo6,7,8,9 e la trascrittomica spaziale10,11 al midollo spinale di questi topi per tracciare un atlante molecolare di recupero dalla paralisi risolto spazialmente. Abbiamo quindi utilizzato il tipo cellulare12,13 e la prioritizzazione spaziale per identificare i neuroni coinvolti nel recupero della deambulazione. Emerse una singola popolazione di interneuroni eccitatori annidati all'interno delle lamine intermedie. Sebbene questi neuroni non siano necessari per camminare prima della lesione del midollo spinale, dimostriamo che sono essenziali per il recupero della deambulazione con EES dopo una lesione del midollo spinale. L’aumento dell’attività di questi neuroni ha fenocopiato il recupero della deambulazione consentito da EESREHAB, mentre la loro ablazione ha impedito il recupero della deambulazione che si verifica spontaneamente dopo una lesione moderata del midollo spinale. Abbiamo quindi identificato una sottopopolazione neuronale che organizza il recupero che è necessaria e sufficiente per riprendere a camminare dopo la paralisi. Inoltre, la nostra metodologia stabilisce un quadro per l'utilizzo della cartografia molecolare per identificare i neuroni che producono comportamenti complessi.

I neuroni che orchestrano la deambulazione risiedono nel midollo spinale lombare14. Per camminare, il cervello trasmette comandi attraverso percorsi discendenti che scendono dal tronco encefalico per attivare questi neuroni15,16. Una grave lesione del midollo spinale (LM) distrugge questo sistema di comunicazione squisitamente organizzato15. Sebbene i neuroni situati nel midollo spinale lombare non siano direttamente danneggiati dalla lesione, l'esaurimento dei comandi sovraspinali essenziali li rende non funzionali4. La conseguenza è la paralisi permanente.

Casi di studio isolati hanno riferito che l'EES può riattivare immediatamente i neuroni non funzionanti nel midollo spinale lombare17,18, consentendo alle persone con paralisi di camminare1,18,19,20. L'applicazione dell'EES durante la neuroriabilitazione (EESREHAB) ha ulteriormente migliorato il recupero della deambulazione, anche quando la stimolazione era disattivata1,21.

I principi biologici attraverso i quali EESREHAB attiva e rimodella il midollo spinale lombare per ripristinare la deambulazione rimangono sconosciuti. Qui, abbiamo ipotizzato che EESREHAB debba coinvolgere e rimodellare i neuroni essenziali ma non identificati nel midollo spinale che diventano necessari per camminare dopo la paralisi.

Per prima cosa abbiamo testato se EESREHAB può ripristinare la deambulazione in un’ampia popolazione di individui con LM e se questo recupero comporta il rimodellamento del midollo spinale lombare.

Nove individui sono stati arruolati nel primo studio clinico sull'uomo "Stimulation Movement Overground" (STIMO) (clinicaltrials.gov: NCT02936453; Informazioni supplementari), che mirava a stabilire la sicurezza e la fattibilità di EESREHAB per migliorare il recupero della deambulazione nelle persone con LM cronica. EESREHAB combina un neurostimolatore impiantato chirurgicamente interfacciato con un elettrodo a paletta multielettrodo che consente il controllo a circuito chiuso dei protocolli EES biomimetici1,2,18 e la neuroriabilitazione in superficie supportata in un sistema di supporto robotico multidirezionale1,22 (Fig. 1a e Tabella supplementare 1) . I primi sei partecipanti presentavano una paralisi motoria grave o completa, ma tutti conservavano un certo grado di sensibilità alle gambe. Gli altri tre partecipanti presentavano una paralisi sensomotoria completa. Ai primi sei partecipanti è stato impiantato un elettrocatetere a paletta riproposto originariamente sviluppato per trattare il dolore neuropatico1 e agli ultimi tre è stato impiantato un elettrocatetere a paletta di nuova concezione e appositamente costruito che mirava a colpire l'insieme di radici dorsali toraciche, lombari e sacrali coinvolte nel dolore neuropatico. produzione del camminare18.

5/session; mixed-effects model, t = –6.40, P = 2.9 × 10–8). e, f, The role of SCVsx2::Hoxa10 neurons in the reorganization of muscle responses to EES was evaluated using Cre-dependent expression of Gi, e, or Gq DREADDs in SCVsx2::Hoxa10 neurons, f. The timelines summarize the timing of the various experimental procedures. The photographs illustrate the expression of DREADD receptors in SCVsx2::Hoxa10 neurons. Long-latency muscle responses to single-pulse of EES were quantified before and 30 min after CNO injections that either silenced (Gi) or activated (Gq) SCVsx2::Hoxa10 neurons. Bar plots report the integral of the RMS of long-latency muscle responses for each each experimental condition (n = 5 mice per group (Gi); paired samples two-tailed t-test, t = 2.4, P = 0.046; n = 5 mice per group (Gq); paired samples two-tailed t-test, t = 2.8, P = 0.047). g, Three complementary strategies were used to evaluate the role of SCVsx2::Hoxa10 neurons during basic unskilled walking in uninjured mice: targeted injections of AAV5-flex-hm4di (Gi) or AAV5-flex-Jaws in the lumbar spinal cord of Vsx2Cre mice to evaluate the short-term or immediate impact of silencing SCVsx2::Hoxa10 neurons, and targeted injection of AAV-flex-DTR to evaluate the long-term impact of the complete ablation of SCVsx2::Hoxa10 neurons. Locomotor performance was evaluated during overground walking using the procedures detailed in Extended Data Fig. 2e (n > 20 gait cycles per mouse, n = 5 mice per group). The bar plot reports locomotor performance, quantified as average scores on PC1 (n = 5 mice per group except for DTR with n = 8 mice per group; paired samples two-tailed t-test, Gi: t = 1.4; P = 0.23; LED: t = 1.5, P = 0.21; DTR: t = 1.1, P = 0.33), and the number of SCVsx2::Hoxa10 neurons per tissue section (SCVsx2::Hoxa10 ablation, n = 7 mice; no ablation, n = 4 mice; independent samples two-tailed t-test, t = 12.3, P = 6.2 × 10–7). Bar plots show the mean with individual data points overlaid. Error bars show the standard error of the mean. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001./p>

20 per mouse, n = 4 mice per group). Bars report n = 4 mice per group; statistics indicate Tukey HSD tests following repeated measures ANOVA, P < 10–15, P = 0.003 and P = 0.002, respectively. c, As in b, but during acute silencing of SCVsx2::Hoxa10 neurons with Gi in mice that underwent four weeks of EESREHAB (n = 4 mice per group; statistics indicate Tukey HSD tests following one-way ANOVA, P = 7.2 × 10–10, P = 2.1 × 10–5, P = 0.0006 respectively). d, As in c, but during acute activation of SCVsx2::Hoxa10 neurons with Gq in mice tested at four weeks post-SCI (no EESREHAB) with EESOFF and EESON (n = 4 mice per group; statistics indicate Tukey HSD tests following one-way ANOVA, P = 3.1 × 10–5, P = 4.4 × 10–7, P = 3.1 × 10–5, P = 0.0069 respectively). e, As in d, but following the chronic silencing of SCVsx2::Hoxa10 neurons (Gi, CNO in drinking water) in mice that underwent four weeks of EESREHAB, chronic activation of SCVsx2::Hoxa10 neurons (Gq, CNO in drinking water) in mice after SCI, and chronic activation of SCVsx2::Hoxa10 neurons (Gq, CNO in drinking water) in mice that underwent four weeks of rehabilitation without EES (n = 5 mice per group; statistics indicate Tukey HSD tests following one-way ANOVA, P = 0.0007, P = 1.6 × 10–5, P = 0.004, P = 0.011, respectively). f, Chronic silencing of SCVsx2::Hoxa10 neurons during EESREHAB altered the connectome and projectome of SCVsx2::Hoxa10 neurons compared to mice that underwent EESREHAB. 3D reconstructions show the labeled neurons in the reticular formation 3 days following the infusion of Cre-dependent PRV Ba2017 in the lumbar spinal cord of Vsx2Cre mice. The density of vGluT1 synapses apposing SCVsx2::Hoxa10 neurons was quantified to evaluate the synaptic projection from large-diameter afferent fibers onto SCVsx2::Hoxa10 neurons. The projectome of SCVsx2::Hoxa10 neurons was vizualized using infusions of AAV-flex-tdTomato in the lumbar spinal cord. The bar plots show the average number of vGluT1 synapses apposing SCVsx2::Hoxa10 neurons (n = 6 mice per group; independent samples two-tailed t-test, t = –3.1, P = 0.018), the number of neurons in the reticular formation (n = 4 and 3 mice per group, respectively; independent samples two-tailed t-test, t = –4.3, P = 0.0076), and the density of projections from SCVsx2::Hoxa10 neurons in the ventral horn (n = 4 mice per group; independent samples two-tailed t-test, t = –9.2, P = 0.0003). g, The impact of the chronic ablation of SCVsx2::Hoxa10 neurons on the natural recovery of mice with thoracic lateral hemisection SCI was evaluated as in Extended Data Fig. 13g, and summarized in the timeline of experiments. Photographs show coronal sections of the hemisected spinal cord at the lesion epicenter, while CLARITY-optimized light sheet microscopy illustrates the interruption of the reticulospinal tract on the hemisected side. Locomotor performances were evaluated as detailed in the other panels. Bar plots, n = 5 mice per group; independent samples two-tailed t-test, t = 6.6, P = 0.0002; t = –3.4, P = 0.09; t = –1.9, P = 0.093, respectively). h, Photographs show coronal sections of the spinal cord with Vsx2 RNAScope, confirming the reduction in the number of SCVsx2::Hoxa10 neurons in the lumbar spinal cord of Vsx2Cre mice after diphtheria toxin injections. Bar plots report the mean number of Vsx2 labeled neurons per section in the spinal grey matter (SCI n = 3, SCI with SCVsx2::Hoxa10 ablation n = 4 mice; independent samples two-tailed t-test, t = 9.5, P = 0.0001). Photographs below show examples of projections from reticulospinal neurons in the lumbar spinal cord in both groups of mice. The plot reports the mean density of reticulospinal projections across the dorsoventral extent of the spinal cord for mice with SCI (n = 3) and mice with SCI and ablation of SCVsx2::Hoxa10 neurons (n = 4). Ribbons show the standard deviation (two-tailed Wilcoxon rank-sum test, W = 2008248, P < 10–15). Bar plots show the mean with individual data points overlaid. Error bars show the standard error of the mean. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001./p>