La biosintesi del colesterolo modula la differenziazione nelle cellule della cresta neurale cranica murina

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 7073 (2023) Citare questo articolo

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Le cellule della cresta neurale cranica (cNCC) sono una popolazione cellulare embrionale multipotente che dà origine a un insieme diversificato di tipi cellulari. Queste cellule sono particolarmente vulnerabili agli stress metabolici esterni, come esemplificato dall’associazione tra iperglicemia materna e malformazioni congenite. Eravamo interessati a studiare l'effetto di varie concentrazioni di glucosio e piruvato sul metabolismo, sulla migrazione e sulla differenziazione del cNCC utilizzando un modello consolidato di cellule della cresta neurale murina (O9-1). Abbiamo osservato inaspettatamente un modello di espressione genica indicativo dell'induzione della biosintesi del colesterolo in condizioni di deplezione di glucosio nelle cellule O9-1. Abbiamo inoltre dimostrato che il trattamento con due diversi inibitori della sintesi del colesterolo interferiva con la migrazione e la differenziazione cellulare, inibendo la condrogenesi e migliorando al tempo stesso la differenziazione delle cellule muscolari lisce. Poiché l'arinia congenita (naso esterno assente), una malformazione causata da mutazioni in SMCHD1, sembra rappresentare, in parte, un difetto in cNCC, eravamo anche interessati a studiare gli effetti della disponibilità di glucosio e colesterolo sull'espressione di Smchd1 nelle cellule O9-1 . L'espressione di Smchd1 è stata indotta in condizioni di glucosio elevato mentre gli inibitori della sintesi del colesterolo hanno ridotto l'espressione di Smchd1 durante la condrogenesi. Questi dati evidenziano un nuovo ruolo per la biosintesi del colesterolo nella fisiologia del cNCC e dimostrano che la variabilità fenotipica umana nei portatori della mutazione SMCHD1 può essere correlata, in parte, alla sensibilità di SMCHD1 al dosaggio di glucosio o colesterolo durante lo sviluppo.

Le cellule della cresta neurale (NCC) sono una popolazione cellulare embrionale transitoria derivata dall'ectoderma che dà origine a un insieme diversificato di tipi cellulari. Durante lo sviluppo embrionale, gli NCC migranti attraversano ambienti diversi con nutrienti unici e attivazione localizzata di enzimi che possono influenzare la loro programmazione genetica e la loro fisiologia1. Gli studi che esaminano l'effetto delle perturbazioni nella disponibilità del substrato mostrano che la regolazione spaziotemporale dello sviluppo è in parte guidata da cambiamenti nel metabolismo2. I cambiamenti metabolici nell'NCC sono temporaneamente associati e possono di fatto stimolare passaggi critici nell'ontogenesi dell'NCC come la proliferazione, la migrazione e la differenziazione3. Inoltre, gli NCC sembrano essere particolarmente vulnerabili agli stress metabolici esterni, di cui l’iperglicemia è un ottimo esempio. Il diabete gestazionale è associato a un rischio più elevato di malformazioni congenite che colpiscono i tessuti e gli organi derivati da NCC (ad esempio, sistema cardiovascolare, scheletrico e nervoso centrale), suggerendo che l'iperglicemia materna è altamente tossica per NCC4,5,6,7. Infatti, i primi studi in vitro hanno dimostrato che condizioni di coltura ad alto contenuto di glucosio inibiscono la proliferazione e la migrazione delle cNCC di ratto a causa della sovrapproduzione di specie reattive dell'ossigeno8. Lavori più recenti sul pulcino hanno inoltre dimostrato che l'esposizione ad alti livelli di glucosio aumenta l'apoptosi e l'autofagia mediata da ERK nello sviluppo di cNCC9 e sopprime la differenziazione delle cellule staminali embrionali in un lignaggio neuronale10. Non sono stati condotti studi, tuttavia, per determinare in che modo la disponibilità di nutrienti influisce sulla fisiologia degli NCC utilizzando la linea cellulare O9-1, una linea multipotente derivata da NCC embrionali di topo11.

Difetti nell'ontogenesi, nella migrazione e/o nella differenziazione delle NCC danno origine a una serie di condizioni chiamate neurocristopatie. La sindrome da microftalmia di Bosma arhinia (BAMS) è una malformazione congenita grave e estremamente rara che sembra riflettere un difetto primario delle cellule NCC12 craniche e delle cellule del placode cranico13 o la loro interazione. Il BAMS è costituito dalla triade clinica composta da arinia (naso assente), difetti oculari e ipogonadismo14 ed è causato da mutazioni nel gene Structural Maintenance of Chromosomes Folding Hinge Domain-containing 1 (SMCHD1)15,16. Tuttavia, la presenza di penetranza incompleta ed espressività variabile nelle famiglie multiplex suggerisce che altri fattori in utero possono influenzare l'espressione o la funzione di SMCHD1. Abbiamo ipotizzato che la disponibilità di nutrienti potrebbe essere uno di questi fattori. Il diabete gestazionale non è stato segnalato nelle gravidanze BAMS, tuttavia è probabile che il BAMS sia sottostimato (< 100 casi segnalati nel secolo scorso15), le linee guida per la diagnosi del diabete gestazionale variano da paese a paese e sono diventate più rigorose nel tempo, e recentemente è è stato riconosciuto che l’iperglicemia materna è linearmente associata al rischio perinatale senza una soglia evidente17. Pertanto, utilizzando il sistema modello O9-1, abbiamo anche studiato l'effetto della disponibilità di nutrienti sull'espressione di Smchd1.

0.6). Given that our experimental design included a gradient of glucose concentrations, we then chose to explore the two modules where there was also a linear gradient in expression change from HG to CG to NG to NG2P. Sixteen modules of co-expressed genes under different glucose conditions were identified. In the turquoise module, gene expression decreased across conditions, whereas in the blue module, gene expression increased across conditions (Fig. 1A, B, Supplementary Table S1). Overenrichment analysis of the turquoise model revealed pathways associated with cell cycle and DNA repair (Supplementary Fig. S1), whereas analysis of the blue module unexpectedly revealed cholesterol biosynthesis, sphingolipid, and glycosphingolipid metabolism (Fig. 1C, Supplementary Fig. S1). Glucose and glucose-derived metabolites provide raw materials for cholesterol synthesis and regulate cholesterol biosynthetic enzymes and uptake23. Glucose depletion would therefore be expected to downregulate cholesterol biosynthesis; however, members of the cholesterol biosynthesis pathway including Hmgcr, the rate-limiting enzyme in cholesterol synthesis, and Hmgcs1, which catalyzes the production of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA)24,25, showed increased expression under NG and NG2P conditions compared to HG (Fig. 1D). Emopamil binding protein (Ebp), which plays a key role in the final stage of cholesterol biosynthesis, was also upregulated in CG vs. HG conditions (Fig. 1D). We next directly measured free cholesterol, esterified cholesterol, and total (i.e., the sum of free plus esterified) cholesterol levels under the various glucose culture conditions. No significant differences were seen in free or total cholesterol, whereas there was lower esterified cholesterol in HG compared with CG, NG, and NG2P conditions (Fig. 2A–C)./p> 0.6. (D) Heatmap of genes involved in cholesterol biosynthesis./p>

80% confluency./p> 1 and Bonferroni-adjusted p < 0.05 were considered differentially expressed./p> 5 in half of the samples. WGCNA was performed using the blockwiseModule utility with with parameter: soft threshold = 22, networkType = "signed", TomType = "signed", deepSplit = 2, minClusterSize = 30, cutTreeDynamic = 0.2522. Modules with a similarity threshold greater than 0.25 were merged. Genes with module membership > 0.6 for the assigned module were selected for pathway analysis with the R gProfileR software package61./p>